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Retraction Notice
The article Assisted Selection of Biomarkers by Linear Discriminant Analysis Effect Size (LEfSe) in Microbiome Data (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology. View Retraction Notice
Abstract
资料来源：Morsch， M.， et.al.， 使用常规紫外激光共聚焦显微镜触发细胞应激和死亡。J. Vis. Exp. （2017）
在本视频中，我们探讨了高强度紫外激光消融技术，用于精确定位和研究转基因斑马鱼中的单个神经元。我们演示了如何准备、固定和可视化神经元反应，突出了损伤和恢复的细胞动力学。
Protocol
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准备琼脂糖中斑马鱼包埋的解决方案。将 4 g/L MS222（三卡因储备液，pH 7.0）滴加到含有蛋水的培养皿中，制备麻醉溶液。建议的起始剂量为 50 mg/L（图 1A）。图 1B）。注意：为此，沿着玻璃底培养皿的内圈放置 ~ 300 μL 琼脂糖，准备一个甜甜圈形的圆圈，中间有一个小开口，将鱼放入其中（步骤 1.5.3）。选择 1 - 3 条预先筛选的鱼进行消融，并通过将幼鱼转移到装有麻醉溶液的培养皿中（使用移液管）来麻醉幼虫（步骤 1.4.1;图 1C;大约 5 分钟）。注意：图 1D）。图 1E）。如果处理多条鱼，请将培养皿中的所有鱼对齐，以便稍后使用共聚焦显微镜轻松定位它们。注意：图 1F）。2. 设置共聚焦显微镜和成像参数
将带有嵌入幼虫的培养皿放在共聚焦显微镜载物台上，并聚焦在动物脊髓的背侧（使用明场）。在适当的放大倍率 （40X） 和荧光设置下检查动物，并可视化感兴趣的结构 （图 2）。我们经常使用 40 倍物镜进行延时研究。例如，使用 z 驱动器，验证感兴趣结构的顶部和底部（单元格 soma）。记下将被消融的 z 平面（单元格的中心）。注意：'例如， 图 43. 对斑马鱼中的单个细胞进行靶向激光消融脊髓
注意：
通过单击软件菜单顶部的下拉菜单（图3A， 1 和 2）。观察一个包含不同步骤的新窗口，该窗口允许设置激光烧蚀的特定参数（， 3）。图 3B 来确定消融方法的图像参数， 4）和平均（， 5）。扫描速度为 400 Hz 且线平均值为 4 的 1,024 x 1,024 图像格式最适用。注意：如果尚未选择用于消融的 z 平面（如步骤 2.4 中所述），请按"实时"按钮并聚焦整个标本，直到荧光结构或要烧蚀的所需 z 平面聚焦。图 3C， 6）来控制特定的消融组件。注意：A激光强度的组合（图 3C， 8）、扫描速度和步骤 3.2 中设置的平均值 （图 3B， 4和 5），以及将在步骤 3.5 中设置的重复次数（， 12），将决定紫外激光器在 ROI 处的总停留时间，从而决定漂白效率。通过激活 405 nm 激光器进行漂白程序来使用它（图 3C， 8）。注意：图 3C7图 3D， 10） 通过使用图像采集窗口中的任何绘图工具（图 3D， 9）。例如，使用大约 4 - 8 μm 的圆形绘图工具瞄准轴突小丘。注意：图 3E， 11）并确认将扫描/消融 ROI 的周期数（图 3E， 12图 3E， 13）并监控消融的效率。注意：例如，图 3C， 8）、扫描速度和平均值 （图 3B， 4和 5）和重复（图 3E， 12），以防所选ROI在FRAP完成后仍然显示高荧光强度周期。
Representative Results
实时成像的嵌入过程：（A） 将三卡因添加到蛋水中以 50 mg/L 的起始剂量率麻醉斑马鱼。（B）制备低熔点琼脂糖 （0.8 - 1.5%） 并加热至 38 - 40 °C。（C）使用移液管，将筛选和选定的斑马鱼转移到装有三卡因溶液的培养皿中。成功镇静后（鳃盖运动浅、心率降低、缺乏触摸诱发反应），将鱼转移到预热的琼脂糖中（D）。尽量减少转移到琼脂糖中的鸡蛋水量，以防止后续稀释。（E）（F）。
3 天大的转基因斑马鱼脊髓中小胶质细胞和神经元的可视化，表达 （A） islet1：GFP）和 （B） mCherry 阳性小胶质细胞 （mpeg1：GAL4，UAS：mCherry）。（C） 神经元和小胶质细胞通道的合成图像以及明场图像。（C） 中的示意图插页描绘了鱼的方向并勾勒出所呈现的区域。比例尺 = 30 μm。
在共聚焦软件（Leica Application Suite）中控制 FRAP 软件模块的步骤。（A） （B）（C） 紫外线消融脊髓神经元神经退行性变的延时成像。（A-F） 单个脊髓神经元的紫外线照射 （met：GAL4，UAS：EGFP;一个;圆圈）导致神经元的胞体随着时间的推移而缩小和向上舍入（A-C），然后是轴突碎片 （C-FD-F）。比例尺 = 20 μm。 Materials 琼脂糖低熔点Fisher-Scientific溶于含0.8-1.5%的三卡因（0.02%）的蛋水中三卡因Argent LabsMS-2220.02%哈佛标准壁硼硅酸盐与细丝毛细管玻璃世界精密仪器， Inc.GC100F-10 （短）GC100F-15 （长）拉力至2 -7 MΩ蛋水 0.6 克速溶海洋海盐，4毫升1毫克/毫升亚甲蓝溶于10升去离子水中热块选择生物产品数码加热块（SBD110_） 显微镜徕卡SP5 35mm玻璃底盘MatTek公司P35G-0-20-C Reprints and Permissions Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article Request Permission